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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷碱化绘制组学、LC-MS/MS磷碱化位点了解技术服务。
英文翻译文章标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
繁体中文大标题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
业主计量单位：山东大学
学习食材：拟南芥侧根
拜谱具备技术应用：磷酸性反应呈现组学、LC-MS/MS磷酸性反应位点了解
科学研究工作思路：
PART 01 分析成果
01、生张素增强VIK的磷过酸举例说明转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷过酸血清质混合物析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 生长发育素促使VIK的磷碱化举例说明转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷碱化实验操作。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酵母粉双杂交种浅析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶专一性影像实验英文（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体之外磷硝化作用实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。24小时定量分析PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素讯号积极向上调节作用 LR 生长发育
在深入分析2个VIK T-DNA导入转变体（vik-2和vik-3），察觉到与也是型相对，转变体的LR高密度单位、LR原基（LRP）和已骨骼健康胸部健康成长的LR同质性缩减，非常是vik-2（图2）。对立，过体现VIK的转遗传DNA茎叶表现形式出LR高密度单位添加。另外，在vik-2转变体蓝本下体现VIK的转遗传DNA茎叶恢复过来了LR骨骼健康胸部健康成长问题。出现的素办理研究揭示，vik-2转变体对出现的素引导的LR骨骼健康胸部健康成长发生反应减小，揭示VIK在出现的素宏观调控LR骨骼健康胸部健康成长中起到要素角色。 
图2 VIK介导的的生长素数据信息环路正在向调空LR的成长发育
03、VIK 与ERF13 做好机械沟通互动
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双分子式荧光同质 （BiFC）和免疫性共积累试验（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13主动帮助
04、VIK以正反两面馈的方案调节管控ERF13磷过酸
通过磷碱化球蛋白组学浅析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点突变率显示显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反面馈手段磷碱化ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷碱化使得ERF13生物降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体研究和身体里研究，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟系统和磷酸灭活突变性体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚肿瘤细胞产品定位剖析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷过酸加快和提升了ERF13挥发
06、VIK 介导的 ERF13 磷过酸改善 LR 的出现了
调查进这一步研讨了VIK改善的ERF13光可降解在侧根（LR）生长发育中的功能。利用较差异的转表观遗传沉水藤本常绿作物系的LR表型，感觉过传达ERF13治理和改善了LR的诞生了，在vik转变体中种治理和改善功能明显增强，而在过传达YFP-VIK的游戏背景下种治理和改善功能减少（图6）。虽然，较ERF13的差异的磷硝化作用模拟仿真训练和磷酸灭活进化体的过传达沉水藤本常绿作物系，感觉ERF132A-Myc（磷酸灭活）的沉水藤本常绿作物系LR诞生了少得多，而ERF132D-Myc（磷硝化作用模拟仿真训练）的沉水藤本常绿作物系LR诞生了略多。一些报告取决于，VIK介导的ERF13磷硝化作用和光可降解推进了LR的诞生了。 
图6 VIK介导的ERF13磷碱化促使LR的出来
07、VIK在侧根发育状况中磷酸性反应并不稳LBD18血清
采用具体分析两种VIK T-DNA放进去转变性体（vik-2和vik-3），遇到与野山型相对比，转变性体的侧根（LR）体积、LR原基（LRP）和已健康的LR正相关避免，尤其是是vik-2（图7）。反着的，过展示VIK的转人类基因水稻组植物展示出LR体积提升。还有就是，在vik-2转变性体题材下展示VIK的转人类基因水稻组植物修复了LR健康偏差。的生長素进行处理实验报告显示，vik-2转变性体对的生長素引诱的LR健康想法变弱，显示VIK在的生長素宏观调控LR健康中发挥出来核心用。 
图7 VIK 在LR建成进程中可以直接磷硝化作用和稳定可靠LBD18核蛋白
PART 02 本文总结ppt
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用蛋白酶质组学具体分析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的的生长素电磁波转换侧根生成
PART 03 拜谱个人总结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的核核蛋白组学、绘制核核蛋白组学、基础代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—很高深度1DIA·磷酸性反应表达组，采用创新聚集工艺+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现部分动物模板10w+、仿真植物模板5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参阅学术论文：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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